Bazylianów, unickich zakonników, do Zamościa sprowadziła Anna z Gniskich Zamoyska w 1706 r. Za zgodą unickiego biskupa chełmskiego Józefa Lewickiego objęli oni cerkiew pw. św. Mikołaja dotychczas prawosławną wraz z zabudowaniami. Ten akt zatwierdził papież Klemens XI.
Anna Zamoyska w 1710 r. przeznaczyła z dochodów ordynacji 200 zł rocznie na utrzymanie księży i drugie 200 zł na remonty cerkwi. Zapis ten zatwierdził w 1718 r. ordynat Tomasz Zamoyski. Jednak te fundusze były małe i niewystarczające na utrzymanie zakonników. Dlatego sprowadzeni do Zamościa bazylianie przez dłuższy czas nie posiadali swego klasztoru. Istniała tylko rezydencja klasztorna, w której mieszkało przy cerkwi dwóch, trzech księży. Ale na generalnej kongregacji w Dubie w 1743 r. postanowiono za zgodą Stolicy Apostolskiej, że wszystkie takie rezydencje, gdzie jest mniej niż sześciu księży zostaną zniesione. Wtedy zamojscy bazylianie udali się z prośbą do ówczesnego ordynata Jana Jakuba Zamoyskiego o pomoc. Ordynat przychylił się do ich prośby i w 1756 r. przeznaczył folwark w Szopinku na utrzymanie sześciu księży. Ponadto w 1757 r. rozpoczął budowę klasztoru dla bazylianów. Wyznaczył też w 1762 r. fundusz misyjny w wysokości 30 tys. zł rocznie z obowiązkiem odbywania każdego roku misji w dobrach ordynacji zamojskiej w celu niesienia w lud Słowa Bożego. Na potrzeby akcji misyjnej składała pieniądze także okoliczna szlachta. W tym czasie w latach 1758-64 przełożonym zakonu bazylianów był o. Herakliusz Kostecki.
W czasie swojej działalności misyjnej bazylianie położyli duże zasługi dla Kościoła i cywilizacji na wschodnich kresach Rzeczypospolitej. Dążyli do realizacji idei zjednoczenia Kościołów. Podczas misji udzielali sakramentów katolikom obydwu obrządków, tzn. zarówno greckokatolickiego, jak również rzymskokatolickiego. Na nabożeństwach przez nich odprawianych gromadziły się tłumy wiernych różnej narodowości.
Ich praca duszpasterska przyczyniała się do łagodzenia sporów polsko-ukraińskich. Bazylianie w Zamościu pracowali gorliwie nie tylko na niwie misyjnej, ale także trudnili się szkolnictwem, kształcąc księży unickich. Do wykładowców w tym czasie należeli Józef Dziokowski, Arkadiusz Daszkiewicz, Orest Nachimowski. Jeszcze wiele lat później, bo w I poł. XIX w. późniejszy biskup unicki chełmski Jan Teraszkiewicz nauki pobierał najpierw w Zamościu, a następnie ukończył uniwersytet we Lwowie.
Złe czasy dla Kościoła greckokatolickiego, a więc i dla zamojskich bazylianów nastały wraz z utratą niepodległości Polski, a szczególnie kiedy Zamojszczyzna po Kongresie Wiedeńskim w 1815 r. znalazła się pod zaborem rosyjskim. Car zdawał sobie sprawę, że wzrost wpływów polskich na ludność ruską odbywa się dzięki cerkwi unickiej. Zaczęły się prześladowania unitów. Rząd rosyjski nienawistny unii brzeskiej wprowadził zakaz wstępowania do bazylianów, co doprowadziło do upadku tego zakonu. Ponadto rozbiory Polski zniszczyły podstawy bytu materialnego klasztoru bazylianów w Zamościu. W 1824 r. miasto Zamość przejął rząd rosyjski. Odtąd żadnych dotacji na jego utrzymanie nie płacił ani rząd, ani ordynacja. Do pogorszenia sytuacji materialnej klasztoru doszło, kiedy podczas oblężenia twierdzy Zamość w czasie powstania listopadowego w 1831 r. spłonęły zabudowania gospodarcze. W wyniku tych wydarzeń budynek klasztorny zaczął popadać w ruinę. W ramach walki caratu z unitami władze rosyjskie Zamościa w części cel klasztornych zakwaterowały oficerów rosyjskich, których odwiedzały kobiety, a oni sami często urządzali huczne, nocne libacje. Żandarmi rosyjscy rozprzestrzeniali fałszywe oskarżenia, że to zakonnicy bazyliańscy źle się prowadzą. Bazylianie w tej sytuacji nie byli zdolni do obrony i przeciwdziałania agresywnej polityce rządu rosyjskiego. Stało się to się głównym powodem przechodzenia ludności zamojskiej obrządku greckokatolickiego na obrządek łaciński.
Ostateczna kasata klasztoru bazylianów w Zamościu nastąpiła w 1865 r., kładąc kres misji dziejowej tych skromnych i gorliwych zakonników. Budynek klasztorny popadł w całkowitą ruinę i został rozebrany. W tym miejscu, po I wojnie światowej i odzyskaniu niepodległości wybudowano klasztor redemptorystów, zakonników obrządku rzymskokatolickiego.
O bazylianach całkowicie zapomniano. Pozostała jedynie nazwa ulicy Bazyliańskiej.